1.染色体分离错误频率

因为在分离错误后观察到初始非整倍体景观的偏差，作者检查了这是否会转化为有偏差的微核含量。通过采用一种可称之为MN-seq的基于荧光激活细胞分选(FACS)的方法来分离微核并通过测序评估其含量，对Cpd -5处理过的细胞的单个或批量排序的微核进行MN-seq，显示出惊人的非随机含量，这与染色体错误分离频率的模式密切相关。

然后作者检查了在自然发生的癌细胞微核中微核含量是否是非随机的。5个染色体不稳定的癌细胞系的MN-seq显示，所有细胞系都存在非随机微核含量，其中两个细胞系(Caco-2和HeLa)的偏性与Cpd-5/ AurBi处理的二倍体细胞高度相似。数据进一步表明，各种癌细胞的分离错误是非随机的，可能是由类似的潜在机制引起的。

3.非随机分离误差的来源

在确定了微核中错误分离和捕获的频率对所有染色体都不相等之后，下一步的目标是了解这种偏差的起源。比较发现分离错误频率与染色体特征质检没有相关性，而RPE1-hTERT细胞中染色体分离错误频率与层相关的染色体结构域(LADs)密度以及染色体距离细胞核中心的公布距离密切相关。

在RPE1-hTERT和其他细胞中，染色体大小与LAD密度相关，包括二倍体(TIG3-hTERT和hESCs)和非整倍体(HeLa, U2OS, K562和HT1080)，这表明在广泛的细胞系中，较大的染色体比较小的染色体更频繁地位于核外周。6条染色体(1、2、6、15、17和18)的着丝粒FISH进一步证实了这一点，在未转化和转化细胞系中都是如此。

为了进一步探索染色体定位可能导致分离误差偏差这一命题，作者实时成像了标记着丝粒和中心体的细胞在有丝分裂过程中的染色体运动，并分析了三类染色体的轨迹:中心位置(cen.)、外周位置(位于纺锤极后(pol.))和外周位置(位于纺锤极平面之间(NPP))。

这表明，在未受干扰的条件下，外周染色体比中心染色体需要更长的时间来聚集，并且在Cpd-5处理下更容易被错误分离为错位或滞后的染色体。

在外周染色体中，极性染色体的组装比非极性染色体慢，错分离的频率高。仅比较从中期板开始距离相等的极性和非极性外周染色体时也是如此。在染色体不稳定的癌细胞中也观察到类似的现象，根据极性的频率，外周和极性染色体发生错位的概率比预期的高三倍。

此外，在有这种错位的中期染色体的细胞中，观察到的后期错位和落后明显比没有这种错位的细胞中更频繁(分别为18/77和3/112)，表明错误分离的染色体往往是由错误排列的染色体引起的。这些观察结果表明，染色体的外周定位，更准确地说是这个位置与纺锤体极点的关系，延迟了双轴取向和聚集，从而导致外周染色体的高频率错误分离。

4.核染色体定位的作用

下一步的目标是研究间期细胞核中染色体的不同位置是否直接导致分离误差概率的变化。在第一种方法中，作者在诱导错误的后期前将有丝分裂中的染色体位置打乱。这是通过使用单单醇短时间处理完成的，它允许在单极轴上进行基于微管的染色体运动，同时使大多数染色体基本上靠近纺锤极。用scKaryo-seq对从monastrol剂中释放到低Cpd-5的单核细胞进行分析，结果表明，在两个不同的细胞系中，染色体错误分离的概率发生了很大的改变。

在第二种方法中，作者利用重复特异性引导RNAs和荧光标记dCas9来成像特定染色体的能力。通常在外围的染色体偶尔可以在细胞核内部找到，反之亦然。这使得我们可以直接将特定染色体的位置与其有丝分裂中的行为联系起来。与从中心位置开始的染色体相比，Cpd -5处理的细胞在后期开始前，从外围位置开始的染色体明显更容易发生错位(染色体1为三倍，染色体9为四倍)。重要的是，与中心起始位置相比，边缘起始位置大大增加了错误分离率(错位和滞后)(染色体1和9分别为1.8倍和2.5倍)。

在最后一种方法中，作者通过雷帕霉素控制的dCas9和Lamin B1二聚体，有条件地将9号染色体固定在核板上，迫使其从中心位置迁移到外周。用雷帕霉素孵育24小时后，靠近外周的9号染色体出现的频率增加了近两倍，这本身并没有影响正常分裂期间的正确分离。然而，在加入Cpd-5后的易出错分裂中，9号染色体的重定位导致误分离率比未重定位的9号染色体增加了近两倍。综上所述，染色体分离错误频率直接受有丝分裂开始前间期核位置的影响。