逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的基本原理是从组织或细胞中提取总RNA，将其中的mRNA作为模板，并利用逆转录酶将其反转录成相应的cDNA。随后，以这些合成的cDNA为模板进行聚合酶链反应（PCR）扩增，从而得到所需的基因或用于检测基因表达的产物。

RT-PCR通过提升RNA检测的敏感性，实现了对微量RNA样品的高效分析。该技术的主要应用包括：分析基因的转录产物、获取目标基因、合成cDNA探针，以及构建具有高效转录能力的RNA系统。

两步法：先RT，再PCR（图片来源于网络）

一步法：在一个反应管内，RT和PCR同时进行

（图片来源于网络）

1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶表现出强大的聚合酶活性，而其RNA酶H活性相对较为有限。其最适操作温度为37℃。

2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶展现出卓越的聚合酶活性和RNA酶H活性，其最适操作温度为42℃。

3、嗜热微生物，如Thermus thermophilus和Thermus flavus，产生的热稳定性反转录酶在Mn2+存在下表现出高温下反转录RNA的能力，有助于消除RNA模板的二级结构。

4、MMLV反转录酶的RNase H-突变体，以Superscript和SuperScriptⅡ为商品名。这种酶相较于其他同类酶更能有效地将更大部分的RNA转换为cDNA。这一特性使得在含有二级结构、难以进行低温反转录的mRNA模板中，能够合成更长的cDNA。

1、随机六聚体引物具有不特异性，用于在特定mRNA因含有使反转录酶终止的序列而难以复制其全长序列的情况下进行反转录。采用这种引物的方法中，体系中的所有RNA分子都作为cDNA的第一链模板，而PCR引物在扩增过程中赋予所需的特异性。通常，通过这种引物合成的cDNA中，有96%来自rRNA。

2、Oligo(dT)是一种特异于mRNA的策略。由于大多数真核细胞mRNA的3'端具有Poly(A+)尾，Oligo(dT)与之配对，只有mRNA才能被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，因此使用这种引物合成的cDNA相比使用随机六聚体引物，得到的cDNA在数量和复杂性方面都较小。

3、特异性引物采用含有目标RNA互补序列的寡核苷酸作为引物，这是引发最为特异反应的一种方法。在PCR反应中，如果使用两个特异性引物，第一条链的合成可以由与mRNA 3'端最靠近的引物起始。通过这种引物，只产生所需的cDNA，从而导致更为特异的PCR扩增。

一、实验材料、试剂、仪器：
组织 细胞。
RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒。

离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒。

二、实验步骤：
（1）、总RNA的提取：见 总RNA的提取 相关内容。

（2）、cDNA第一链的合成
目前市面上有多家生物试剂公司提供各种cDNA第一链试剂盒，它们的基本原理相似，但具体的操作步骤可能有所不同。以下以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis试剂盒为例说明。

1、在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；

2、70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；

3、取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA   2 ul；上游引物（10 pM） 2 ul；下游引物（10 pM） 2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul） 1 ul。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；

 4、加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；

5、于70℃加热15 min以终止反应；

6、将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

（3）、PCR
1、取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA   2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；

2、加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。轻轻混匀，离心；

3、设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；

4、电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

5、密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

1、在实验过程中，需采取措施防止RNA的降解，以保持RNA的完整性。在进行总RNA提取时，特别需注意避免mRNA的断裂；

2、为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；

3、内参的设定主要用于靶RNA的定量。常用的内参包括G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免由于RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一和不同孔间温度差异等引起的误差；

4、PCR反应出现平台效应与扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA的起始数量有关，因此不能确定PCR反应何时进入平台期。为了确定每个目标序列的平台效应循环数，需要进行单独的实验；

5、为了防止DNA的污染，可以采用DNA酶处理RNA的方法。在可能的情况下，建议将PCR引物放置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。