今日小编带大家将深入剖析细胞调控领域中的一项重要技术——TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）检测方法。这一技术以其高度精准的细胞死亡检测而著称，对于揭示细胞内部的分子机制至关重要。本文将全面剖析TUNEL检测技术的原理、操作流程以及其在科学研究中的广泛应用。精湛的科技背后是对生命过程的深刻理解，今天让我们一起来解锁TUNEL检测技术的专业精髓！

在细胞凋亡过程中，染色体DNA的断裂经历了多个渐进的阶段。首先，内源性核酸水解酶引发染色体DNA的降解，形成50-300kb的大片段。接着，大约30%的染色体DNA在Ca²+和Mg²+依赖的核酸内切酶的作用下，被随机切断，形成180~200bp核小体DNA多聚体。随后，由于DNA双链断裂或单链缺口，一系列DNA的3’-OH末端可通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的介导，与脱氧核糖核苷酸和其他化合物（如荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素）结合，标记在DNA的3'-末端。这一过程被称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)，可用于检测凋亡细胞。

这一方法可用于检测凋亡的组织切片，包括经过福尔马林固定并进行石蜡包埋的切片、冰冻切片，以及培养或从组织中分离的细胞。除此之外，该技术还可广泛应用于评估抗肿瘤药物的疗效。通过采用双色法，它不仅能够确定细胞死亡类型，还能精确判定细胞所处的分化阶段。这使得该技术成为研究细胞行为和药物疗效的重要工具，具备广泛而有力的应用前景。

1. 标本预处理
    （1）对石蜡包埋的组织切片进行预处理的步骤如下：首先，将组织切片放置在染色缸中，通过二甲本进行两次5分钟的洗涤。接着，使用无水乙醇进行两次3分钟的洗涤，随后使用95%和75%乙醇各进行一次3分钟的洗涤。然后，使用PBS进行5分钟的洗涤，随后加入蛋白酶K溶液（浓度为20 ug/ml），在室温下进行15分钟的水解，以去除组织中的蛋白质。最后，使用蒸馏水进行4次2分钟的洗涤，然后按照步骤2进行后续操作。
    （2）对冰冻组织切片进行预处理的步骤如下：首先，将冰冻组织切片放置在10%中性甲醛中，在室温下进行10分钟的固定，然后去除多余液体。接着，使用PBS进行两次5分钟的洗涤。将组织切片置于乙醇和乙酸（比例为2：1）的溶液中，在-20℃处理5分钟，然后去除多余液体。再次使用PBS进行两次5分钟的洗涤，随后按照步骤2进行后续操作。
    （3）对培养的或从组织中分离的细胞进行预处理的步骤如下：首先，将浓度为约5 × 10^7个/ml的细胞置于4%中性甲醛中，在室温下进行10分钟的固定。然后，在载玻片上滴加50-100 μl的细胞悬液，并使其干燥。接着，使用PBS进行两次5分钟的洗涤，随后按照步骤2进行后续操作。

2. 色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5 min。用PBS洗两次，每次5 min。

3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1-5 min。

4、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1 h（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5. 将切片放入染色缸中，然后加入已经预热至37℃的洗涤与终止反应缓冲液。在37℃下保温30分钟，每隔10分钟轻轻提起和放下载玻片一次，以轻微搅动液体。

6. 对组织切片进行处理的步骤如下：先使用PBS进行3次5分钟的洗涤，然后直接在切片上滴加两滴标有过氧化物酶的抗第高  辛抗体。在湿盒中，让其在室温下反应30分钟。

7. 用PBS洗4次，每次5 min。

8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05% DAB溶液，室温显色3-6 min。

9. 用蒸馏水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min。

10. 在室温下，使用甲基绿进行10分钟的复染。随后，进行3次蒸馏水洗涤，前两次每次提起放下载玻片10次，最后一次静置30秒。然后，以相同的方式使用100%正  丁醇进行三次洗涤。

11. 用二甲本脱水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

1. 必须建立阳性和阴性细胞对照。

2. 作为阳性对照的切片可以采用部分被DNaseI降解的标本，阳性细胞对照则可使用经过地塞米松（1 μM）处理3-4小时的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。

3. 阴性对照中不添加TdT酶，其余步骤与实验组相同。