2024-01-09 15:04:21
一文理清免疫荧光实验流程和常见问题!

你是否曾对免疫荧光实验心生疑虑?在这个充满微观奇妙的生物医学世界中,免疫荧光实验是一项不可或缺的重要技术。今天,小编将带你解密免疫荧光实验的奥秘!!深入探索免疫荧光的实验步骤、注意事项以及常见问题。


简介

免疫荧光技术是一种建立在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础之上的先进技术。它基于抗原抗体反应的原理,首先将已知的抗原或抗体标记上荧光标签,然后使用这些荧光标记的抗体(或抗原)作为探针,用来探查细胞或组织中的相应抗原(或抗体)。通过荧光显微镜,可以清晰可见荧光信号在细胞或组织中的位置,从而确定抗原或抗体的性质、分布以及通过定量技术(例如流式细胞仪)来测定其含量。这项技术为科学研究和医学诊断提供了强大的工具,使我们能够深入了解生物分子的相互作用和细胞内过程。


实验步骤


免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。


(一)、细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)

免疫荧光实验的第一步是准备细胞片,而细胞片的质量对整个实验的成功起着至关重要的作用。这是因为,如果在细胞片制备过程中发生细胞掉落或损坏,那么实验将无法继续进行。这一步的关键在于精细处理玻片(Slides或Coverslips)并确保细胞保持活力。只有在这一步骤中细致入微地处理好细胞片,才能为后续的免疫荧光实验奠定坚实的基础。


具体操作步骤: 
细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。


(二)、固定和通透

最关键的是,必须根据研究对象的抗原性质,明智地选择适用的固定方法。选用正确的固定剂和遵循适当的固定程序,对于获得出色的实验结果至关重要。这是确保实验成功的重要一环,因为固定是为了保持抗原的完整性,使其能够被有效地检测和分析。


具体操作步骤:
固定:根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。


通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min。


(三)、封闭和抗体孵育

与其他方法(例如ELISA或Western Blot)的许多步骤相似,免疫荧光实验的主要区别在于其使用了荧光标记的抗体。因此,在进行该实验时,必须特别注意避光操作,以保持荧光信号的稳定性。此外,抗体浓度的选择在免疫荧光实验中可能具有更加关键的意义,因为它会直接影响到实验结果的质量和解释。


具体操作步骤:
封闭:使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。
一抗结合:室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min。
二抗结合:间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。


(四)、荧光检测

最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

具体操作步骤:
封片及检测:滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。


注意事项

为进行免疫荧光实验,我们需要准备细胞样本,而这些细胞样本有多种来源和处理方式。

一种是可以使用直接附着在盖玻片上的贴壁细胞。这类细胞在培养时,只需将盖玻片放入培养皿中,细胞便会在上面黏附并生长。这种方法特别适用于附着性较好的细胞类型,因为可以减少后续漂洗步骤时细胞脱落的风险。


另一种选择是使用离心分离后的悬浮细胞,这些细胞需要制备成涂片。此外,还可以从体内组织中获得细胞悬液,然后通过离心制备成涂片,这适用于特定实验需求。


在选择细胞准备方式时,需根据具体实验的要求和所使用的细胞类型来决定,以确保最终获得可靠的免疫荧光实验结果。


案例展示


图片

图片来源于网络


常见问题


1、无/弱染色烤片温度过高,推荐56℃-60℃1-2h;一抗是否适用固定液和石蜡切片,使用浓度是否过低,孵育是否时间过短等。


2、非特异性背景染色是否灭活内源性过氧化物酶;孵育过程中干片;抗原热修复过度。


3、染色过深一抗浓度过高;染色试浓度过高或孵育时间过长;染色剂浓度过高或孵育时间过长。


总结


免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。


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