细胞克隆形成实验，作为细胞生物学中的关键技术之一，不仅在学术研究中有着广泛应用，更在药物筛选、癌症研究等领域发挥着重要作用。通过此实验，我们能够深入了解细胞的增殖能力、侵袭性，以及对不同治疗因素的敏感性，为生物医药领域的创新提供坚实的基础。

本期文章，我们将深度解析平板克隆和软琼脂克隆这两种常用实验方法，揭示它们的原理、实验步骤以及注意事项！

平板克隆实验过程

材料：基础培养基(根据细胞选择适用种类)、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素溶液(100X)、多聚甲醛固定、结晶紫染液、 Giemsa染液 。

实验步骤：

（1）6孔板
1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)重悬成细胞悬液，并计数。

2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔)。 

3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。

4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次。  

5.每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min。

6.PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)。

克隆形成原始图片（图片来源于网络）

注意事项：

1.每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。    

2.染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。

（2）平皿
1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)中备用。

2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 

3.置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。 

6.去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟。

7.用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。  

DU145细胞克隆形成的图片（相机左，显微镜右）

（图片来源于网络）

注意事项：
1.平板克隆形成实验是一种容易操作的方法，特别适用于那些贴壁生长的细胞。这种实验通常在玻璃底或塑料培养皿上进行。

2.实验的关键成功因素在于细胞悬液的制备和接种密度。细胞悬液必须确保细胞均匀分散，不能有细胞团，而且接种密度不应过高。

数据分析：

使用显微镜观察阳性克隆，即每个克隆包含超过50个细胞，然后使用相机拍照记录。随后，进行克隆数量的计算，这些克隆的大小通常在0.3到1.0毫米之间，并统计各个克隆的大小。

例如，在研究某个基因对细胞增殖的影响，如敲低前列腺癌细胞株PC3的TCTN1基因，可以使用显微镜拍摄图像（比例尺为250微米），然后使用相机拍摄照片。结果显示，TCTN1基因的敲低抑制了克隆的形成，减小了克隆的数量和大小。

（图片来源于网络）

软琼脂克隆形成

软琼脂克隆形成实验，又被称为非锚定依赖性生长实验（Anchorage-independent assay），利用软琼脂作为培养介质，推动细胞在悬浮状态下进行生长。某些恶性肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能够增殖，而且在悬浮状态下同样能够展现增殖能力。这种通过在软琼脂中形成克隆的能力能够有效反映细胞的恶性程度。

软琼脂克隆形成实验不仅可用于深入研究细胞分化的基本原理，同时也为评估临床肿瘤治疗的疗效提供了有力工具。在医学和生物学领域，该实验发挥着重要的作用，为我们更全面地理解细胞行为、肿瘤发展机制以及潜在治疗策略的效果提供了关键信息。

具体过程如下图所示：

（图片来源于网络）

1.配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固。      

2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固。   

3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次。

4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，37°C过夜，拍照。

5. 数据分析：显微镜或相机拍照，计算克隆形成率。
例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少。

（图片来源于网络）

注意事项：
1.在培养皿中涂覆上层的软琼脂，以确保细胞分散成单个状态；接下来，涂抹下层的软琼脂，起到支撑作用，以防止细胞附着并生长。最后，涂覆一层培养基，以防止琼脂干燥，并为细胞提供所需的养分。如果需要对细胞进行药物处理，药物可以添加到培养基中。

2.上层软琼脂中的细胞数量会根据不同的细胞类型而有所不同。通常，使用5000个细胞/孔作为起始浓度，但可以根据需要进行调整。

3.琼脂需要在水浴锅中维持在约42℃左右的温度。如果温度太低，琼脂会凝固，而如果在制备底层琼脂时凝固过快，可能导致不均匀。另一方面，温度过高可能会导致细胞受热而死亡。此外，在实验过程中需要操作迅速，以防止局部结块的发生。