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在生物医学领域中，染色质免疫共沉淀（ChIP）实验是研究基因表达调控机制的关键工具。这一精密技术通过揭示细胞内染色质上蛋白质与DNA的相互作用，为深入理解基因调控、疾病发生提供了关键信息。然而，ChIP实验的成功涉及到甲醛交联、超声波断裂、免疫沉淀等复杂步骤。本文将深入剖析ChIP实验内部机制，探讨其中的技术原理和实验步骤。通过解析这些内幕，我们旨在为科研人员提供更深入的理解和实验指导，确保他们能够在这一领域中取得更准确可靠的实验结果。
简介
染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一项在表观遗传学研究中广泛应用的方法，能够迅速揭示蛋白质与DNA之间的相互作用。
染色质免疫沉淀法（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一项基于抗原抗体反应的技术，通过特异性相互作用，有选择性地富集DNA结合蛋白及其DNA靶标。该方法用于在全基因组水平研究生物体组织或细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术。
（图片来源于网络）
技术原理
在生物医学领域的实验中，采用生理条件下的方法，通过将细胞内的DNA与蛋白质进行交联，接着利用超声或酶处理将染色质切割成小片段。接下来，通过抗原抗体的特异性反应，实现将与目标蛋白结合的DNA片段沉淀。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、反转交联、DNA纯化以及DNA鉴定等关键步骤。由于CHIP实验包含多个步骤，其结果的可重复性相对较低，因此需要在每个步骤中引入相应的对照实验，并对实验结果进行有经验的分析。这有助于确保实验的准确性和可靠性。
研究意义
核酸和蛋白质是组成生物体的主要生物大分子，它们之间的相互作用在维持生命活动中起着关键作用，涵盖了生长、繁殖、运动、遗传和代谢等重要生命过程。深入研究蛋白质与核酸之间的相互作用对于揭示生命现象的奥秘至关重要。CHIP检测实验作为一项重要的工具，有助于探索蛋白质与核酸之间复杂而精密的互作关系，为理解生物体内分子层面的调控机制提供了关键信息。这种实验方法在生物医学研究中具有重要意义，为深入解析细胞内生物分子相互作用提供了突破口。
实验材料
器材：静音混合器、高速低温离心机、超声破碎仪、电泳仪、水平电泳槽、PCR仪、Real-time PCR仪
试剂：HeLa细胞、HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、SDS、NaHCO3、去氧胆酸钠、EDTA、Tris、蛋白酶抑制剂、蛋白酶 K、Protein A／Gbeads（鲑精DNA）、对照引物（GAPDH）、阳性对照抗体［乙酰化组蛋白H3抗体（Anti-Acetyl HistoneH3）］、阴性对照抗体［正常家兔IgG（Normal IgG）］、琼脂糖、PCR反应 Mix、SYBR Green qPCR Mix
实验步骤
实验步骤基本过程可分为如下几步： （一）试剂配制 （1）裂解（FA Lysis）缓冲液 50 mmol／L HEPES-KOH,pH 7.5;140 mmol/L NaCl; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0；1％ Triton X-100；0.1％ 去氧胆酸钠；0.1％ SDS；蛋白酶抑制剂（临用前加入）。 （二）细胞固定 （1）取一个直径为150毫米的培养皿，其中细胞的汇合度约为80%至90%（例如HeLa细胞数量约为1x107个）。在培养皿中加入20毫升培养基，然后添加550微升37%甲醛（或1100微升18.5%甲醛），以使甲醛的最终浓度达到1%。 （三）染色质断裂 （1）将含有细胞裂解液的离心管放置在冰上，并进行超声破碎。超声功率设定为310瓦，进行20秒的冲击，间隔2秒，总共进行3次超声处理。具体的超声条件可能会因不同的细胞系和细胞数量而有所变化，需要根据实验摸索来确定。在超声处理过程中，超声探头应尽量深入管中，但不要接触到管底或侧壁，以防止产生泡沫。 （2）超声破碎后，10000 g、4 ℃，离心10 min，去除细胞碎片等不溶物质。 （4）取100微升超声破碎后的产物，加入5微升蛋白酶K（浓度为20毫克/毫升），在65摄氏度条件下进行旋转混合，并解除交联，持续4至5小时（或过夜）。随后，将一半样品进行酚-氯 仿抽提处理，以便进行后续的处理。最终，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测超声效果。 （四）染色质免疫沉淀 （1）将每管50微升的超声破碎产物稀释至1:10的比例，加入450微升RIPA缓冲液。从中留取5微升（占1%体积）作为Input对照，并将其保存在4摄氏度，以供后续步骤（第4步操作）使用。 （五）解交联反应和DNA的纯化 利用蛋白酶K，在65摄氏度条件下保温4至5小时，进行解除交联。接着，通过DNA纯化柱回收DNA，或者选择酚-氯 仿抽提的方法，随后通过乙醇沉淀进行DNA的纯化。 （六）DNA的鉴定 最常用的DNA鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。 （七）实验结果及分析 （1）交联后的染色质经超声波断裂，2％ 琼脂糖凝胶电泳分析结果，打断后的染色质片段的平均长度应该在200～1000 bp左右。
（2）RIPA缓冲液 50 mmol／L Tris-HCI，pH 8.0；150 mmol/L NaCl；2 mmol/L EDTA,pH 8.0;1% NP- 40；0.5％ 去氧胆酸钠；0.1％ SDS；蛋白酶抑制剂（临用前加入）。
（3）漂洗（Wash）缓冲液 0.1％ SDS；1％ TritonX-100;2 mmol/L EDTA，pH 8.0;150 mmol/L NaCl; 20 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0。
（4）最终漂洗（Final Wash）缓冲液 0.1％ SDS；1% Triton X-100;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;500 mmol/L NaCl;20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
（2）温和混匀，室温孵育10 min。
（3）终止交联：加甘氨酸至终浓度为125 mmol／L，温和混匀，室温孵育5 min。
（4）将平皿置于冰上。
（5）吸尽培养基，用20 ml冰冷的PBS清洗细胞。
（6）吸尽PBS，重复清洗细胞1次。
（7）加入2 ml冰冷的PBS（含有1x蛋白酶抑制剂复合物），用细胞刮刀收集细胞，于1.5 ml离心管中。
（8）1000 g、4 ℃，离心5 min。
（9）吸去上清液，加入750 μl FA Lysis缓冲液，重悬细胞，得到细胞裂解液。
（3）吸取上清液分装至新1.5 ml离心管中，每管50 μl（可于-80 ℃保存3个月）。
（2）在每个样品管中分别加入阳性对照抗体、阴性对照抗体（正常IgG）以及目标蛋白抗体，抗体的用量范围为1至10微克。根据抗体的效力、纯度和特异性，通过梯度稀释抗体，进行实验以确定 最适合的抗体用量。
（3）加入20 μl充分混匀的 Protein A／G beads（Salmon Sperm DNA）。
（4）4 ℃，旋转混合，1 h或过夜。
（5）2000 g，离心1 min，弃去上清液。
（6）清洗beads 3次，每次用1 ml Wash缓冲液，2000 g离心1 min，弃去上清液。
（7）清洗beads 1次，用1 ml Final Wash缓冲液，2000 g离心1 min，弃去上清液。
（1）每份样品中均加入120 μl Elution 缓冲液（包括Input对照组），30 ℃，旋转混合，15 min。
（2）2000 g离心1 min。
（3）吸取上清液至一新的离心管中，可于-20 ℃保存。
（4）加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋转混匀，解交联4～5 h（或过夜）。
（5）DNA用酚-氯 仿抽提，乙醇沉淀，加100 μl水溶解DNA，可于-20 ℃保存。
（2）纯化后得到的DNA片段经PCR分析，扩增片段为管家基因GAPDH的启动子区，片段大小165 bp，阳性对照和Input对照可见扩增产物，无DNA模板PCR对照无扩增产物，阴性对照可见微弱扩增 条带，但与阳性对照比较差别明显。
注意事项
（1）为了确定甲醛交联的反应时间，需要进行预实验，因为在不同细胞类型和数量下，甲醛交联的效果会有所不同。过长的交联时间可能导致实验材料丢失，而且超声打断可能难以有效进行；而过短的交联时间则可能导致不完全的交联。 （2）超声波是通过机械力断裂染色质，容易引起升温或泡沫产生，从而导致蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。在进行超声波断裂染色质时，应在冰上进行，并设计断续的超声程序，避免过长的超声时间，以免蛋白质降解。 （3）在ChIP实验中，进行良好的实验对照至关重要，缺少对照会使得难以评估实验结果的可靠性。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。同时，进行充分的Input对照不仅可以验证染色质断裂效果，还能根据Input中靶序列的含量和染色质沉淀中靶序列的含量，按照取样比例计算ChIP的效率。 （4）选择染色质免疫沉淀实验中使用的目的蛋白抗体是ChIP实验成功的关键。由于蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能与结合位点过近，无法被抗体识别，从而影响免疫沉淀复合物在体内有效形成。 因此，并非所有抗体都适用于ChIP实验，只有经过ChIP实验验证的抗体才能确保实验结果的可靠性。