细胞迁移是指细胞在外部信号的驱动下，从一个特定位置迁移到另一个位置的复杂生物过程。在生物体内，这一过程在多个生理和病理学情境下发挥着关键作用，包括但不限于损伤修复、肿瘤转移、免疫细胞的迁移以及组织修复等生命活动。

在肿瘤学研究中，评估肿瘤细胞侵袭性是一项至关重要的测量标准，可用于评估与肿瘤相关的信号通路、药物治疗、靶向治疗以及致癌/抑癌基因的效果。因此，在肿瘤研究中，经常需要对肿瘤细胞的侵袭能力进行全面的测试。为此，Transwell实验被广泛采用，作为一种常见的实验方法，用于精确评估细胞的迁移和侵袭能力。这一实验系统通过模拟生理环境，为研究者提供了独特的平台，使其能够深入探究肿瘤细胞在侵袭性方面的特性和机制。

Transwell实验，又被称为Transwell迁移或侵袭测定，是一项在细胞生物学和分子生物学领域广泛应用的实验室技术，其主要目的是研究细胞在多孔膜上的运动机制。该实验常用于研究细胞对各种刺激，如生长因子、趋化因子或细胞外基质成分，引发的迁移、趋化性和侵袭行为。Transwell实验对评估细胞穿越多孔屏障进行迁移或侵袭的能力特别有益，因为多孔屏障模拟细胞在体内组织的生理条件下的移动。

Transwell实验包括Transwell小室（插入物）和孔板，这是一种由渗透膜隔离的装置，用于划分两个隔室。通常，顶部室中充满细胞，而底部室则含有化学引诱剂或诱导细胞迁移的物质。多孔膜允许细胞通过膜上的微小孔从顶部室迁移到底部室。

根据是否在小室内添加基质胶，Transwell实验分为两种类型：

迁移测定（未添加基质胶）： 在这种测定中，细胞从顶部室迁移到底部室，但无需降解或侵入膜。这一类型的测定旨在评估细胞对化学引诱剂梯度的响应，展示其移动能力。

侵袭测定（需添加基质胶）： 在侵袭测定中，细胞不仅通过多孔膜迁移，还需要通过通常涂覆在膜顶部的细胞外基质（ECM）层降解或侵袭。例如，侵袭测定常用于研究肿瘤细胞的侵袭行为。

作为研究细胞行为的关键工具，Transwell实验不仅可以深入了解癌症转移、免疫细胞迁移和组织发育等多种生物过程，还通过计算迁移或侵袭的细胞数量，或测量各种细胞参数（如细胞运动和趋化反应）的变化，来量化细胞行为。

1.测定细胞的迁移能力

2. 测定细胞的侵袭能力

3. 对细胞迁移和侵袭能力有影响作用的药物药效评价

（一）、基底膜水化前处理：

在进行Transwell迁移/侵袭实验之前，需要对基底膜进行水化处理，以确保适当的细胞迁移环境。

具体步骤如下：

每个孔中加入50 μl无血清培养液，然后在37℃的室温下进行30分钟的基底膜水化。这个步骤有助于提供一个适当的基质环境，为细胞的迁移和侵袭提供必要的条件。

（二）、细胞悬液制备：

首先，将细胞处于饥饿状态，去除细胞周围的血清影响，通常需要饥饿12～24小时。

消化细胞后，通过离心将培养液去除，并使用PBS洗涤1～2次，确保细胞的纯净性。

使用含有BSA的无血清培养基重新悬浮细胞，调整细胞密度至5×10^5 个/ml。这一步确保在Transwell小室中接种的细胞悬液具有适当的浓度。

（三）、细胞接种：

取100 μl的细胞悬液，加入Transwell小室中。这一步将细胞悬液均匀地分布在Transwell小室的顶部。

在孔板的下室中加入600 μl含有10% FBS的培养基。这一步提供了一种引导细胞迁移的环境，促进细胞通过基底膜向下室迁移。

根据实验需要，培养细胞的时间通常为12～48小时，主要依据细胞的迁移能力而定。这一步允许细胞逐渐迁移穿过基底膜，模拟体内细胞的迁移过程。

（四）、结果统计步骤

一、直接计数法

a）“贴壁”细胞计数：

在这一步骤中，关注的是细胞在膜下层黏附的情况，可以通过染色方式标记这些细胞，例如结晶紫染色、台盼蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色。以下是详细的操作步骤：

细胞固定：小心地取出Transwell小室，吸去上室内的培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。然后，在一个新的24孔板中加入600μL的4%多聚甲醛，将小室放入其中进行固定，固定时间为20-30分钟。

细胞染色：吸去上室内的固定液后，将小室移至预先加入约800μL 0.1%-0.2%结晶紫染料的孔中，让细胞染色15-30分钟。接下来，去除未与细胞结合的结晶紫，通过轻轻用棉签擦拭小室的上侧，去掉那些非特异性地附着在小室上表面的染料，以便在后续的镜检中进行计数。

细胞计数：轻轻用清水多次冲洗，将小室取出后，吸干上室内的液体。然后，使用湿棉棒小心地擦拭上室底部膜表面上的细胞。接下来，小心地使用镊子将膜揭下，确保底面朝上，然后等待适当的时间使其风干。将膜转移到载玻片上，并使用中性树胶进行封片。在高倍显微镜下观察和拍照，随机选择5个视野（包括上、下、中央、左、右各一个），并计数呈紫色的阳性细胞，最后统计结果。

b）“非贴壁”细胞计数：

由于细胞特性或膜的性质，有些细胞在穿过膜后无法附着在膜的表面，而是掉入下室。在这种情况下，可以选择两种方法计数细胞数量：一是收集下室内的培养液，然后使用流式细胞仪计数；二是直接在显微镜下进行细胞计数。

二、间接计数法

a）MTT法：

MTT可以穿透细胞膜并进入细胞内，在细胞内还原为蓝紫色晶体。通过测定其光吸收值在490nm波长下，可以间接反映活细胞的数量。这种方法广泛用于测定生物活性因子的活性、筛选抗肿瘤药物、进行细胞毒性实验以及评估肿瘤对放射线的敏感性等。

b）结晶紫检测：

该方法的原理与MTT法相似，通过在细胞染色后使用3%醋酸进行脱色，然后测定洗脱液的光密度值（波长为570nm），间接反映细胞的数量。

1.在进行基底膜铺胶的过程中，基质胶在室温下会迅速凝固，因此整个过程需要在冰上进行操作，以确保胶液不会提前凝固。

2.基质胶的浓度是影响细胞迁移和侵袭的重要因素之一。因此，根据供应商提供的信息和具体实验情况，需要调整基质胶的浓度和稀释比例。一般常用浓度为1mg/mL。

3.铺胶时，建议垂直向小室底部中间加入基质胶，以最大程度避免气泡的产生。

4.吸出小室内未结合的基质胶时，务必确保移液管的尖端不会刮伤凝胶层表面，以维持凝胶的完整性。

5.不同细胞具有不同的迁移和侵袭能力，可以设置一系列细胞密度梯度，以寻找适当的细胞接种密度。

6.在小室放置过程中，容易产生气泡。一旦气泡产生，下层培养液的趋化作用可能会减弱或消失。因此，在小室放置过程中需要格外注意。一旦发现气泡，需要及时提起或使用枪头去除，然后重新放置。

7.接种细胞后的1-2小时内，建议对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。尽管有时可能会观察到极小的气泡，但它们通常不会影响细胞的迁移和侵袭，可通过轻轻敲击孔板来去除。

8.在用PBS清洗小室时，避免物理触碰小室底部。可以事先准备几个无菌烧杯或培养皿，倒入适量PBS，然后依次涮洗，以提高清洗效率。

9.在拍照前，需要适当晾干小室，因为水分会影响镜下视野。确保小室表面干燥，以获取清晰的图像。