细胞外基质（ECM）扮演着细胞内重要的生存支持系统，其组成不仅包括胶原、糖蛋白、蛋白多糖等元素，还富含大量的蛋白酶、细胞因子以及黏附分子。在肿瘤转移的复杂过程中，ECM的基底膜特别是一个生理屏障，必须被克服。基质金属蛋白酶家族（MMPs）则能够降解细胞外基质，协助肿瘤细胞克服这一屏障，为细胞增殖提供必要的空间。MMP2和MMP9是主要负责降解基底膜上IV型胶原和明胶的基质金属蛋白酶，它们与恶性肿瘤的浸润转移关系密切。通过蛋白电泳技术，可以检测MMP2和MMP9的活性。

MMP2和MMP9之前被称为明胶酶A和B，因为它们能够裂解变性的胶原蛋白或明胶。

MMP的分类（图片来源于网络）

明胶酶谱法可用于：

（1）明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9）的测定；

（2）测定明胶酶的抑制剂；

（3）细胞与组织中明胶酶的定位。

2.试剂、试剂盒：

聚丙烯酰胺凝胶、明胶、浓缩胶、Tris-甘氨酸缓冲液、Triton X-100、过  硫  酸  铵、甲醇、醋酸、考马斯亮蓝、蛋白质上样缓冲液。

3.仪器、耗材：

电泳糟、pH计、凝胶成像仪、离心机、电泳仪、细胞培养瓶、倒置显微镜、超净台、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、液氮罐、微型旋转柱、旋转混合仪。

一、主要试剂的配制

1、平衡缓冲液：50 mmol/L Tris（pH7.5），0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol/L 邻二氮菲。

2、洗涤缓冲液1：50 mol/L Tris（pH7.5），0.5 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，0.05％Tween 20，5 mmol/L邻二氮菲。

3、洗涤缓冲液2：50 mmol/L Tris（pH7.5），10 mmol/L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol/L邻二氮菲。

4、8％分离胶（含0.1％明胶）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol/L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 过硫酸铵（APS）100 μl，TEMED 6 μl。

5、浓缩胶：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol/L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％ SDS 30 μl，10％过硫酸铵30 μl，TEMED 3 μl。

6、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：0.125 mol/L Tris-HCl，1.25 mol/L 甘氨酸，0.5％ SDS。

7、5×上样缓冲液：30％ 1 mol/L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚蓝。

8、洗脱液：2.5％ TritonX-100（去离子水定容）。

9、孵育液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L CaCl2，1％ TritonX-100，pH7.5，去离子水定容。

10、染色液：0.25％考马斯亮蓝R-250，45％甲醇，10％乙酸。

11、脱色液：30％甲醇，10％乙酸。

二、实验方法

1、收集生长对数期的癌细胞培养液。

2、将500μl培养液，45μl明胶琼脂糖颗粒（使用前混匀）和45μl平衡缓冲液混合均匀后加入微型旋转柱中，于旋转混合仪上平衡30min。

3、用洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒，每次100μl洗涤3次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液1。

4、用100μl洗涤缓冲液2洗涤琼脂糖颗粒1次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液2。

5、向微型旋转柱中加入40μl的2x上样缓冲液，7000r/min离心。将离心后的上样缓冲液重新加入微型旋转柱中，于12000r/min离心10s。

6、采用8%分离胶在130V恒压下电泳2.5h。

7、用洗脱液在摇床上洗涤蛋白胶2次，各30min，除去胶中的SDS。

8、37℃孵育蛋白胶24h，使MMP分解明胶。

9、摇床上染色1h及脱色至条带清晰。

10、蛋白成像：用凝胶成像仪进行拍照。

（图片来源于网络）

（1）在合成聚丙烯酰胺的过程中，需要特别留意排除气泡。

（2）活性明胶酶谱受到多种因素的调控，包括钙离子、锌离子以及pH值等。因此，在配制缓冲液时应确保准确无误，最好选用超纯水。此外，需严格控制孵育温度，以确保最佳的酶活性。

（3）为了避免样品中的酶发生变性和失活，不建议对蛋白样品进行沸腾处理，且在上样缓冲液中应避免含有β-巯基乙醇或DTT。

（4）为了最优效果，建议孵育液的pH保持在7.5到7.6之间。使用经过复性处理的Triton过长时间可能导致产生絮状物，因此在实验中最好采用新鲜配置的溶液。

（5）建议在普通的孵化箱中，而非CO2培养箱中进行37℃的孵育，因为CO2培养箱可能改变孵育液的pH值。

（6）明胶要4℃保存，配好后1周内使用。