首页
新闻资讯
肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells，CSCs）的存在对肿瘤治疗和疾病管理提出了挑战。与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞具有更强的自我更新能力和肿瘤形成能力，同时还表现出对放化疗的抵抗性，这使得它们成为治疗策略中的一个重要目标。为了深入研究肿瘤干细胞的特性和生物学行为，开发和应用适当的实验方法至关重要。肿瘤干细胞成球实验是一种常用的方法，通过模拟体内的微环境条件，在体外培养中富集和鉴定肿瘤干细胞。本文将介绍肿瘤干细胞成球实验的原理及其在实验中的具体步骤。
简介
肿瘤干细胞成球实验是一种用于富集肿瘤干细胞的方法。在这个实验中，单个细胞被分散在培养皿中，而不是依附于表面。大多数细胞因为无法附着而逐渐死亡，但是少数细胞可以形成细胞球体，也就是一团细胞，而且这些细胞团在体外培养时能够进行多次传代。研究发现，这些细胞球体具有肿瘤干细胞的特性，当移植到动物模型中时，它们能够生长成肿瘤并连续多次移植。因此，细胞成球实验被广泛用于富集肿瘤干细胞。细胞球的大小和数量被认为是评估肿瘤细胞干性的重要标志，通常用细胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）来衡量。
实验原理
在无血清但富含特定细胞因子的培养条件下，肿瘤干细胞显示出一项独特的能力：它们能够形成聚集成团的克隆肿瘤球，形态类似于葡萄串。相比之下，普通肿瘤细胞在这种培养条件下无法有效增殖。这一特性使得在成球培养过程中，肿瘤干细胞能够优先增殖，从而在群体中占据主导地位。这种筛选和富集的效应有助于从混合细胞中提取和纯化肿瘤干细胞。
实验目的
通过观察细胞球的大小和数量，可以评估细胞的干性程度。这种评估主要侧重于单个细胞在适当的培养基条件下自我更新的能力。
实验材料
实验所需材料包括： 1. 超低吸附培养皿：可选择6/12/24孔板，用于细胞培养。 2. 基础培养基：根据细胞需要选择，例如1640或者DMEM/F12。 3. B27（50X）营养液：含有抗氧化剂、蛋白质、维生素和脂肪酸，有助于促进细胞快速增殖，并减少氧化损伤。 4. 重组表皮生长因子（EGF）：调节细胞生长和增殖，促进细胞新陈代谢。 5. 碱性成纤维生长因子（bFGF）：又称FGF2，有助于保持细胞的未分化状态。 6. 胰岛素（Insulin）：常添加于无血清细胞培养液中，维持细胞生长，调节细胞对葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的利用，同时抑制糖原、蛋白质和脂肪的分解。
实验步骤
一次成球： 1. 将生长状态良好的细胞消化后离心，去除含血清的培养基，用PBS清洗2次。 2. 用干细胞培养基（DMEM/F12+1×B27+20ng/ml bFGF+20ng/ml EGF）重悬细胞，并进行计数。 3. 细胞铺板：选择超低吸附的六孔板，每孔铺播N个细胞（500-5000个，根据细胞的成球能力），并补加4毫升培养基。 4. 细胞球培养：使用DMEM/F12培养基，添加20 μl /ml B27、20 ng /ml EGF和20 ng /ml bFGF。将A549细胞制成单细胞悬液，以20,000个/孔的密度种植到六孔板中，每孔2 ml培养液，每隔2～3天换液一次。在37℃，5% CO2条件下培养，利用显微镜观察细胞球的形态和成长情况。实验取第3代细胞球。 5. 大约经过10天（不同细胞培养时间可能有所不同）完成培养，观察细胞球的状态。 二次成球： 1. 收集一次成球得到的细胞球，离心去上清，用胰酶消化。 2. 加含血清的培养基终止消化，离心去除含血清的培养基，用PBS清洗2次。 3. 用干细胞培养基重悬细胞，并进行计数。 4. 细胞铺板：铺板的细胞数量应与一次成球铺板的细胞数量相同。 5. 大约经过10天（不同细胞培养时间可能有所不同）完成培养，观察细胞球的状态。
——