材料准备

1.仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2.玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。

3.塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。

4.其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5.试剂：D-Hanks 液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

细胞冻存

1. 配制冻存培养液：配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。

2. 处理细胞：取对数生长期的细胞，使用胰蛋白酶将单层生长的细胞消化下来，对于悬浮生长的细胞，直接将细胞移至15ml离心管中。

3. 离心：进行1,000 rpm，5分钟的离心。

4. 调整细胞密度：去除胰蛋白酶和旧的培养液，加入适量的配制好的冻存培养液。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后计数并调节冻存液中细胞的最终密度为5×10^6/ml～1×10^7/ml。

5. 分装细胞：将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。

6. 标记冻存管：在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间及操作者。

7. 冻存过程：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；直到-100℃时，可迅速浸入液氮中。另一种方法是将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2小时，然后放入-70℃冰箱中过夜，最后将冻存管移入液氮容器中。

细胞冻存步骤（图片来源于网络）

细胞复苏

细胞复苏的步骤如下：

1. 取出冻存管：从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动，促使其尽快融化。

2. 处理细胞悬液：从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，将其加入离心管中，并滴加10倍以上的培养液，然后混匀。

3. 离心：进行1,000 rpm，5分钟的离心。

4. 调整细胞密度：弃去上清液，加入含10%小牛血清的培养液以重悬细胞。进行计数，调整细胞密度后，将其接种到培养瓶中，并置于37℃培养箱中，静置培养。

5. 继续培养：次日更换一次培养液，继续进行培养。

细胞复苏方法（图片来源于网络）