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彗星实验，是一种有效评估DNA损伤程度的方法。其基本原理是，在处理器官或组织后（如辐射或重金属暴露），细胞内的DNA可能会出现单链或双链断裂。在细胞裂解后，DNA会解旋并迁移出核，然后在电场的作用下形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的DNA在电场作用下会迁移较短的距离，保持在核内，形成圆形或轻微拖尾的图谱。

根据电泳缓冲液的pH值，彗星实验可分为中性（pH=8.4）和碱性（pH＞13）两种类型。中性实验主要用于检测DNA双链断裂，而碱性实验则更为敏感，可检测到更少量的单链和双链断裂。

在进行实验时，样品准备、电泳条件、视觉分析参数（如染色强度、显微镜光强度）以及环境条件（如背景照明）等方面都需要仔细控制，因为它们可能会影响到DNA的迁移。

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1.单细胞悬液制备：

   - 使用胰酶消化细胞至离心管中，并进行细胞计数。

   - 使用PBS调节细胞密度至每毫升105~106个。

2.制胶：

   - 在预热的载玻片上滴加第一层0.5%正常熔点琼脂糖，然后迅速盖上干净的盖玻片，置于4°C静置10分钟使其凝固。

   - 准备混合液，将10微升含有10000个细胞的PBS和75微升10.5%低熔点琼脂糖在37°C混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含有细胞的低熔点琼脂糖滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，再次置于4°C静置10分钟使其凝固。第三层胶的制备与第一层相同，然后再次盖上盖玻片。

3. 裂解：

   - 移除盖玻片，将载玻片浸入新配置的RIPA细胞裂解液中，至少裂解2.5小时（尽量使每张玻片裂解时间相同）。此步骤的目的是通过去垢剂和高盐溶液除去溶解细胞膜和核膜，除去蛋白质、RNA等，仅留下核骨架。

4.解旋和电泳：

   - 细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，然后将载玻片置于水平电泳槽中。

   - 倒入1XTBE电泳缓冲液，覆盖胶面0.25厘米，进行碱解旋20分钟，然后在4°C冰箱中电泳25~30分钟，电压设置为25V。

5. 染色：

   - 将载玻片取出，用滤纸吸干电泳缓冲液，然后用Tris-HCl(pH 7.5)中和15分钟。

   - 然后在每片载玻片上滴加50微升30ug/mL的溴化乙锭(EB)溶液，进行避光操作。

   - 盖上盖玻片，避光染色20分钟。

6. 镜检核图像分析：

   - 尽快将EB染色后的样本放置在荧光显微镜下观察，并拍摄电泳图谱的图像。

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1.细胞密度控制： 细胞需要被准确计数，以确保每张凝胶上的细胞密度为1×10^4个/ml。密度过大会导致软件分析困难，而密度过小则会增加工作量，因为单个视野下的细胞数量较少。

2.凝胶制备： 无论是采用2层凝胶法还是3层凝胶法，都必须严防脱胶的发生，以保证凝胶的完整性和稳定性。

3.试剂配制和操作一致性： 在细胞裂解、解旋、电泳、中和和染色等步骤中，必须精确配制试剂。所有实验组所使用的试剂和操作时间必须完全一致，以确保实验结果的客观性和可比性，避免产生偏差。