一、实验原理

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30%的染色体DNA在Ca²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。   

二、应用简介

本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定，还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

三、实验流程

四、 样本送检要求

五、 案例展示

六、常见问题

1、出现非特异性荧光标记

①　有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。

②　使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。

③　TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。

2、荧光背景很高

①　支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。

②　高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。

③　TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。

④　红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。

3、标记效率低

①　使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。

②　固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。

③　荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。

④　碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。

七、服务流程