一、实验原理

DNA甲基化存在于大多数真核生物中，BSP甲基化测序通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理，非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶，在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基，在反应完成时被保留，我们将扩增得到的PCR产物进行TA克隆测序，可以分析甲基化发生的具体情况。该方法实验结果准确性高，是甲基化检测的金标准。

二、 应用简介

在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

三、 实验方法

四、 样本送检要求

五、案例展示

六、常见问题

1、蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2、RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。

3、验证提取DNA的纯度的方法有二：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。第二种方法可以完全明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

4、基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

5、所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

6、亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

7、水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。 

8、在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。 

9、乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

10、异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。 此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。  

11、PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。

12、凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

13、紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。 

14、回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。   

15、涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上； 

16、不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。 

七、服务流程